在菌液OD₆₀₀=0.6条件下，以继代5 d的胚性愈伤组织为外植体，研究真空压力和侵染时间对转化率的影响。由表2可以看出在0.05 Mpa和0.07 Mpa真空压力条件下，侵染15 min和20 min的抗性愈伤率几乎相同，20 min比15 min的稍高，但是在实验中我们发现，同等压力条件下，愈伤侵染20 min比15 min的难抑制菌，而且状态不好；相同侵染时间时，0.07 Mpa比0.05 Mpa的愈伤难抑制菌，而且状态不好；综合考虑选择0.05 Mpa真空压力，侵染15 min的转化条件。

表2真空压力和侵染时间对玉米遗传转化的影响 Table 2 Effect of vacuum pressure and infection time on maize transformation

1. 4转基因植株的分子生物学检测 
通过该优化体系转化1260块H99胚性愈伤组织，共获得转化植株18株，经过PCR初步鉴定，其中9株呈阳性，抗性植株阳性率为50%，图2结果显示，转基因植株扩增出375 bp的目的条带，和阳性对照一致，可以初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。

图2 转基因植株PCR分析 Figure 2 PCR analysis on transgenic plants 注: M: DL2000; -: 阴性对照; +: 阳性对照; 1-9: 转基因植株 Notes: M: DNA marker; -: Negative control; +: Positive control; 1-9: Transgenic plants

2讨论 
为了建立完善的农杆菌介导的玉米遗传转化体系，本实验以H99胚性愈伤组织为外植体，研究了胚性愈伤组织状态、农杆菌浓度、侵染时间和真空压力等因素对转化效率的影响，并应用该体系将耐盐基因HAL1转入自交系H99中。试验中发现，胚性愈伤组织状态对转化效率影响非常明显，当以继代5d的胚性愈伤组织为外植体，抗性愈伤获得率高于其他条件，这说明此状态的愈伤组织刚好处于对数生长期，比较利于转化。菌液浓度对转化频率有着直接影响，当OD₆₀₀=0.6时抗性愈伤率最高为35.33%，但是当浓度过高时(OD₆₀₀＞0.6)，由于吸附得菌液过多，对愈伤组织的伤害增大，后期的抑制菌难度增加，转化率反而降低。在本实验中还尝试了真空压力对遗传转化的影响，在0.05 Mpa和0.07Mpa真空压力条件下，侵染15 min和20 min的抗性愈伤率几乎相同，但是发现同等压力条件下，侵染时间长的难抑制菌，而且状态不好；相同侵染时间时，真空压力越大越难抑制菌；综合考虑选择0.05 Mpa真空压力，侵染15 min的转化条件。因此选择继代5 d的愈伤组织、菌液浓度OD₆₀₀=0.6和0.05 Mpa真空压力侵染时间15 min为目前本实验室的玉米农杆菌转化的转化条件，要建立一套转化效率高的完善体系，还需要研究影响遗传转化效率的其他因素，我们将在以后的试验中继续优化。

通过该优化体系将耐盐基因HAL1转入玉米自交系H99的愈伤组织(1 260块)中，经过3 d共培养，4 d恢复培养，三次除草剂(Bar3.0mg/L)筛选后，获得转基因玉米材料18株，经过PCR初步鉴定，其中9株呈阳性，抗性植株阳性率为50%，初步证明外源基因HAL1已经整合到玉米基因组中。转HAL1植株的获得将为玉米抗旱耐盐的新品系玉米品种培育奠定良好的基础。

3材料与方法
3.1 材料
3.1.1 植物材料   
玉米自交系H99。

3.1.2 植物表达载体  
植物载体为pC3301-HAL1，含有目的基因HAL和筛选标记基因Bar(图3)。

图3 pC3301-HAL1载体结构简图 Figure 3 Schematic representation of pC3301-HAL1 vector

3.1.3培养基
实验中所用到的培养基如下：YEP培养基：酵母提取物10g/L + 蛋白胨 10g/L + NaCl 5 g/L，pH=7.0；侵染培养基：1/2 MS大量，1/2 MS微量，1/2 MS维生素，100 mg/L肌醇，水解酪蛋白500 mg/L，2,4-D 1.5 mg/L AS100 mg/L+3.6%蔗糖+ 6.8%葡萄糖，pH=5.2；愈伤组织诱导培养基：MS大量，MS微量，MS维生素，100 mg/L肌醇，水解酪蛋白500 mg/L，L-脯氨酸500 mg/L，L-天门冬酰胺200 mg/L，泛酸钙0.5 mg/L，生物素0.05 mg/L，2,4－D 1.5 mg/L，蔗糖 4％(w/v) pH=6.0；继代培养基：MS大量，MS微量，MS维生素，100 mg/L肌醇，水解酪蛋白500 mg/L， 2.4－D 2.0mg/L，蔗糖3％(w/v) pH=6.0；共培养培养基：1/2 MS大量，1/2 MS微量，1/2 MS维生素，2,4-D 1.5 mg/L AS100 mg/L AgNO₃ 850 mg/L+半光氨酸100 mg/L+3%蔗糖pH=6.0；恢复培养基：1/2 MS大量，1/2 MS微量，1/2 MS维生素，2,4-D1.5 mg/L +MES 0.5g+AS100 mg/L+Cef 500 mg/L+3%蔗糖pH=6.0；筛选培养基： 1/2 MSZ+2,4-D 1.5 mg/L +MES 0.5 g +Cef 500 mg/L+除草剂（Bar 3.0 mg/L）+3%蔗糖pH=6.0；分化培养基：继代培养基+KT 0.5 mg/L +Cef 500 mg/L代培养基+KT 0.5 mg/L +Cef 500 mg/L pH=5.8；生根培养基：继代培养基+IBA 0.5 mg/L +Cef 500 mg/L+活性炭5 g/L pH=6.0。

3.2方法
3.2.1 外植体的获取
取授粉9~13d，1mm左右的幼胚接种在诱导培养基上，每14d继代一次，继代3次后得到胚性愈伤组织。

3.2.2农杆菌转化
3.2.2.1工程菌的制备
将含有质粒pC3301-HAL1的农杆菌EHA105在含相应抗生素的YEP液体培养基中28℃， 180 rpm培养至OD₆₀₀值在0.8左右，离心5 min收集菌体，然后用侵染培养基重悬菌体，加入乙酰丁香酮(AS) 100 μmol/L，调整重悬液浓度至OD₆₀₀=0.6。

3.2.2.2 外植体的侵染
将继代0~12d的愈伤组织分别集中于小三角瓶中，用OD值为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的重悬菌液在不同真空压力条件下侵染5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，侵染结束后将愈伤组织置于带滤纸的培养皿中，吸去多余菌液后放在共培养基上，21℃共培养3 d。

3.2.3转化植株的获得
3.2.3.1抗性愈伤组织的的筛选
共培养3 d后的愈伤组织转移至恢复培养基中，恢复培养4 d后转移至筛选培养基中筛选抗性愈伤组织。每14 d筛选一次，3次筛选后得到抗性愈伤组织。

3.2.3.2抗性愈伤组织的分化
筛选得到的抗性愈伤组织置于分化培养基中，在27℃，2000Lx光强，每天光照16 h的条件下分化生长，直至得到幼苗。

3.2.3.3 壮苗培养和移栽 　
将幼苗放在生根培养基中生长，待根系发达后，敞开瓶口炼苗，1周后移栽于温室。

3.2.3 转化植株的PCR检测
3.2.3.1  DNA的提取  
当转化植株处于4叶期时取玉米幼嫩的叶片，用CTAB法提取转基因玉米的基因组DNA。

3.2.3.2  PCR检测抗性植株 
根据HAL1的基因序列设计引物PCR 引物： PR :5’CCAGAAACCCACGTCATGCC3’     PF:5’CAGGAACCGCAGGAGTGGA3’；反应体系为20 μl。PCR扩增序为：(1) 95℃，预变性 5 min；(2) 95℃，变性1 min；(3) 56℃，退火 30s；(4) 72℃，延伸 30s；(5)重复步骤(2)~(4)40次；(6)72℃延伸10 min。PCR产物大约375bp。

作者贡献
孙传波是本研究的实验设计和论文初稿的写作，孙传波、郭嘉、陶蕊、孟凡梅和曲文利参与实验研究的执行和数据分析；韦正乙提供植物表达载体，李海华负责转化植株在责温室的生长，刘文国和袁英是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项课题(2009ZX08003-018B)资助。

参考文献
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